Микроскопия микробиологических препаратов.

Микроскопическое исследование клинических образцов (мокроты, гноя, отделяемого из ран, ликвора и пр.) является важным этапом микробиологического анализа, позволяющим получить предварительные данные о качественном и количественном составе микрофлоры в патологическом матери­але, а также оценить соответствие материала очагу воспаления. Иногда микроскопия помогает выявить микробы, не растущие на обычных питательных средах.

Микроскопия мазков из чистых культур бактерий позволяет определить их морфологию, что наряду с окраской по Граму является важным ориентиром в выборе направления последующей их идентификации.

При изучении микробиологических объектов чаще используют световую микроскопию окрашенных препаратов под иммерсией (объектив х 90).

При микроскопии в темном поле эффект создается при помощи специального конденсора-параболоида или обычного конденсора с прикрытой кружком черной бумаги центральной частью, а объект кажется светящимся на фоне темного поля зрения. Препарат готовят по типу раздавленной или висячей капли; применяется для индикации спирохет, боррелий, лептоспир.

Фазово-контрастная микроскопия может использоваться для изучения без предварительной обработки бесцветных, прозрачных объектов (живых клеток, срезов тканей и т.п.), детали строения которых оптически мало различаются между собой. Суть метода заключается в том, что с помощью специального устройства конденсора и объектива разность фазовых колебаний, проходящих через биологический объект и окружающую среду световых волн, недоступных человеческому глазу, преобразует­ся в разность интенсивностей (амплитуд) света, благодаря чему детали строения объекта становятся видимыми. Метод аноптральной микроскопии является дальнейшим развитием метода фазового контраста (в его основе сохраняется тот же принцип) и отличается большей разрешающей способностью объективов и возможностью выявления минимальных оптических разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Люминесцентная микроскопия позволяет получить цветное изображение самосветящихся объектов на черном фоне свысокой степенью их контрастности с помощью люминесцентного микроскопа. Она основана на явлении флюоресценции (или люминесценции), когда некоторые вещества под влиянием падающего на них света испускают лучи с другой (обычно большей) длиной волны. Поэтому вещества, имеющие определен­ный цвет при обычном освещении, при освещении ультрафиоле­товыми лучами приобретают совершенно иную окраску. Объект, не видимый в ультрафиолетовом свете, может пробрести яркий блеск после обработки его флюоресцирующим веществом (флюорохромом). В таком препарате сила свечения объектов бывает различной, но чаще всего она невелика, поэтому люминесцентную микроскопию следует проводить в затемненном помещении. В зависимости от используемого флюорохрома применяют строго определенный набор светофильтров. Важно ис­пользовать специальное нефлюоресцирующее иммерсионное масло.

Для обнаружения и идентификации бактериальных антигенов ис­пользуют меченые флюорохромом иммунные сыворотки в реакциях прямой и непрямой иммунофлюоресценции.

Приготовление препаратов для микроскопии

От качества приготовления препарата во многом зависит ре­зультат микроскопии.

Предметные и покровные стекла должны быть чистыми и хорошо обезжиренными. Это достигается разными способами, из которых наиболее доступны нижеследующие:

• стекла кипятят 15 мин в 1% растворе соды (или в мыльной воде), споласкивают водой, помещают в слабую соляную кислоту и, наконец, хорошо промывают водой;

   •    стекла обрабатывают жидкостью следующего состава: калия бихромат 20 г, серная кислота (техническая) 20 г, вода 200 мл; после 20 минут кипячения в этой смеси промывают стекло водой, а затем спиртом. Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси рав­ных количеств спирта и эфира, или в 96° спирте, или промытыми и вытертыми досуха.

Микроорганизмы можно исследовать в живом состоянии и в окрашенных препаратах.

а) Исследование микроорганизмов в живом состоянии про­водят для изучения формы и подвижности бактерий либо ввисячей, либо в раздавленной капле.

Для висячей капли необходимо иметь специальное предметное стекло с луночкой. Маленькую капельку бульонной культуры наносят на покровное стекло; если исследуют агаровую культуру, то на покровное стекло предварительно наносят небольшую каплю воды или физиологического раствора, куда затем вносят петлей незначительное количество бактерий и размешивают их. Можно заранее приготовить взвесь культуры в физиологическом растворе и взять капельку из нее. И в том, и в другом случае на покровное стекло накладывают предметное стекло так, чтобы капля оказалась в луночке, края которой предварительно смазы­вают вазелином. Стерла слегка прижимают друг кдругу, в резуль­тате чего они склеиваются, образуя герметически закрытую камеру, в которой капля долго не высыхает. Препарат микроскопируют покровным стеклом кверху.

Для раздавленной капли пользуются простым предметным стеклом, куда наносят материал (физиологический раствор и культуру), накрывая его покровным стеклом. Капельки нужно брать такой величины, чтобы они заполняли все пространство между стеклами и не выступали за края покровного (избыток материала удаляют фильтровальной бумагой). Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Для микроскопии лучше использовать фазово-контрастную или ант-ропольную установку.

б) Исследование окрашенных препаратов позволяет не толь­ко изучить морфологию бактерий, но и судить о некоторых деталях их химического строения, что достигается применением специальных красок.

Для приготовления препаратов из жидких культур каплю мате­риала наносят на предметное стекло и размазывают петлей. Из культуры на плотной среде берут петлей ничтожное количество и раз­мешивают в заранее нанесенной на стекло капле воды или физиологического раствора, размазывая по стеклу до диаметра мазка 1,5-2 см. Мазок высушивают на воздухе, затем его фиксируют (в этом случае мазок будет хорошо держаться на стекле, а убитые бактерии лучше воспринимают окраску). Самый простой и распространенный способ — фиксация жаром. Держа стекло мазком вверх, его трижды проводят через пламя газовой или спиртовой горелки (время фиксации не должно превышать 5-6 сек, а время прямого воздействия пламени — 2 сек). Во избежание перегрева препарата контролем может служить прикосновение стекла к тыльной поверхности ладони (должно быть ощущение легко переносимого жжения). Для фиксации можно использовать химические вещества: этиловый 95° спирт (время фиксации 10-15 мин), метиловый спирт (2-3 мин), ацетон (5 мин), смесь равных объемов абсолютного спирта и эфира по Никифорову (10-15 мин) и др.)